Usu è precauzioni di u tubu di centrifuga ultrafiltrazione
1) Sceglite un tubu di ultrafiltrazione adattatu.Innota chì e membrani UF sò diffirenti in u so livellu di tolleranza à diversi sustanzi chimichi.Di genere, i tubi d'ultrafiltrazione cù un cut-off di u pesu molekulari di 10 kDa ponu esse selezziunati cun un cut-off di u pesu molekulari chì ùn deve esse più grande di 1 / 3 di u pesu molekulari di a proteina d'interessu, cum'è 35 kDa.Se u pesu moleculare di a proteina d'interessu hè di circa 10 kd, un tubu di ultrafiltrazione cù un cut-off di pesu moleculare di 3 KD pò esse usatu.
(2) L'ultrafiltrazione, appena acquistata, hè secca, cù l'acqua ultrapura aghjunta prima di l'usu è l'acqua passava cumplettamente à traversu a membrana, bagnu di ghiacciu o frigorifera pre cooled per uni pochi di minuti.L'acqua hè poi versata, vale à dì u liquidu di prutezione, è quantu hè aghjuntu, quellu chì ùn hè micca più di a linea bianca à a cima di u tubu.L'operazione hè ligera, è u tubu di ultrafiltrazione deve esse precooled nantu à u ghjacciu prima di aghjunghje a suluzione di prutezione.
3) Sia a massa è u centru di gravità anu da ghjunghje à u equilibriu.Nota chì a velocità di rotazione è l'accelerazione ùn sò micca assai veloci, altrimente dannu direttamente a membrana di ultrafiltrazione.L'ultrafiltrazione centrifuga hè stata cuminciata (centrifuga precooled à 4 gradi).Dopu chì l'RPM di diverse centrifughe hè stata cunvertita in g, era diversu.L'accelerazione di a centrifuga hè stata adattata à u minimu, riducendu a pressione nantu à a membrana.Nota, assicuratevi di lascià a centrifuga dopu chì a centrifuga hà righjuntu a so velocità di destinazione, o se avete un prublema, ùn pudete micca trattà per a prima volta.L'orientazione di a membrana à u spindle hè stata aghjustata secondu l'istruzzioni (casu di centrifuga angulare hè a membrana à l'assi perpendiculare).In l'usu praticu, a vitezza di rotazione generale hè più bassa di quella in l'istruzzioni, perchè a vita di u tubu di centrifuga pò esse allargata.
3) Sia a massa è u centru di gravità anu da ghjunghje à u equilibriu.Nota chì a velocità di rotazione è l'accelerazione ùn sò micca assai veloci, altrimente dannu direttamente a membrana di ultrafiltrazione.L'ultrafiltrazione centrifuga hè stata cuminciata (centrifuga precooled à 4 gradi).Dopu chì l'RPM di diverse centrifughe hè stata cunvertita in g, era diversu.L'accelerazione di a centrifuga hè stata adattata à u minimu, riducendu a pressione nantu à a membrana.Nota, assicuratevi di lascià a centrifuga dopu chì a centrifuga hà righjuntu a so velocità di destinazione, o se avete un prublema, ùn pudete micca trattà per a prima volta.L'orientazione di a membrana à u spindle hè stata aghjustata secondu l'istruzzioni (casu di centrifuga angulare hè a membrana à l'assi perpendiculare).In l'usu praticu, a vitezza di rotazione generale hè più bassa di quella in l'istruzzioni, perchè a vita di u tubu di centrifuga pò esse allargata.
(4) Quandu si cuncentra à u restu 1ml, pigliate 50ul di suluzione buffer, aghjunghje 10ul di flussu attraversu è vede s'ellu ci hè un culore blu, cum'è un ghjudiziu se u tubu di ultrafiltrazione manca a proteina.Se u tubu hè leaky, re pour a capa superiore è u flussu in un novu tubu per inizià a ultrafiltrazione.Per determinà precisamente se i tubi anu mancatu, centrifuga per 10 minuti cù 5mgml di BSA prima di u flussu, currendu nantu à a cola di proteina, o l'analisi cruda di Bradford, è cuntinueghja aghjunghjendu a suluzione di proteina concentrata restante (chì opera nantu à u ghjacciu è impedisce à e proteine di riscaldamentu) finu à chì. tuttu u cuncentratu hè statu aghjuntu.Prestate attenzione durante a centrifugazione se a precipitazione di proteine si verifica, chì porta à a chiusura di u tubu.Se a precipitazione si trova, stabilisce se a causa specifica di a precipitazione hè una concentrazione eccessiva di prutezione o un buffer inappropriatu;U primu pò esse risoltu da l'ultrafiltrazione di più tubi d'ultrafiltrazione simultaneamente, diminuendu a cuncentrazione, è l'ultime scambiendu diverse suluzioni buffer finu à chì ùn ci hè micca precipitazione di a proteina.
(4) Quandu si cuncentra à u restu 1ml, pigliate 50ul di suluzione buffer, aghjunghje 10ul di flussu attraversu è vede s'ellu ci hè un culore blu, cum'è un ghjudiziu se u tubu di ultrafiltrazione manca a proteina.Se u tubu hè leaky, re pour a capa superiore è u flussu in un novu tubu per inizià a ultrafiltrazione.Per determinà precisamente se i tubi anu mancatu, centrifuga per 10 minuti cù 5mgml di BSA prima di u flussu, currendu nantu à a cola di proteina, o l'analisi cruda di Bradford, è cuntinueghja aghjunghjendu a suluzione di proteina concentrata restante (chì opera nantu à u ghjacciu è impedisce à e proteine di riscaldamentu) finu à chì. tuttu u cuncentratu hè statu aghjuntu.Prestate attenzione durante a centrifugazione se a precipitazione di proteine si verifica, chì porta à a chiusura di u tubu.Se a precipitazione si trova, stabilisce se a causa specifica di a precipitazione hè una concentrazione eccessiva di prutezione o un buffer inappropriatu;U primu pò esse risoltu da l'ultrafiltrazione di più tubi d'ultrafiltrazione simultaneamente, diminuendu a cuncentrazione, è l'ultime scambiendu diverse suluzioni buffer finu à chì ùn ci hè micca precipitazione di a proteina.
(5) I primi passi sò usati per cuncentrazione di a proteina, è se u buffer deve esse cambiatu, aghjunghjite delicatamente un novu buffer (ultrafiltrazione attraversu una membrana di ultrafiltrazione 0.22um) à circa 1ml di proteina tutale, è riconcentrate à circa 1ml per trè. volte consecutivi, cù u voluminu finali cuncintratu finali sicondu a cuncintrazzioni di prutezione desiderata, generalmente micca più di 500ul, ma ancu à 200ul.Ottene 1000 × o più in trè occasioni, essenzialmente quantu cambiamentu di buffer, cum'è calculatu da almenu 10 × o più arricchimentu di u voluminu ogni volta.
(5) I primi passi sò usati per cuncentrazione di a proteina, è se u buffer deve esse cambiatu, aghjunghjite delicatamente un novu buffer (ultrafiltrazione attraversu una membrana di ultrafiltrazione 0.22um) à circa 1ml di proteina tutale, è riconcentrate à circa 1ml per trè. volte consecutivi, cù u voluminu finali cuncintratu finali sicondu a cuncintrazzioni di prutezione desiderata, generalmente micca più di 500ul, ma ancu à 200ul.Ottene 1000 × o più in trè occasioni, essenzialmente quantu cambiamentu di buffer, cum'è calculatu da almenu 10 × o più arricchimentu di u voluminu ogni volta.
Tempu di Postu: Nov-09-2022