PCR, hè a reazione in catena di polimerasi, chì si riferisce à l'aghjunzione di dNTP, Mg2+, fattori di allungamentu è fattori di rinfurzà l'amplificazione à u sistema sottu a catalisi di l'ADN polimerasi, utilizendu l'ADN genitore cum'è mudellu è primers specifichi cum'è u puntu di partenza di l'estensione , Attraversu i passi di denaturazione, annealing, estensione, etc., u prucessu di replicazione in vitro di DNA di filamentu figliu cumplementarii à l'ADN di mudellu di filamentu parente pò amplificà rapidamente è specificamente qualsiasi DNA target in vitro.
1. Hot Start PCR
U tempu di iniziu di l'amplificazione in a PCR cunvinziunali ùn hè micca di mette a macchina PCR in a macchina PCR, è dopu u prugramma principia à amplificà.Quandu a cunfigurazione di u sistema hè cumpleta, l'amplificazione principia, chì pò causà amplificazione non specifica, è a PCR hot-start pò risolve stu prublema.
Cos'è una PCR di partenza calda?Dopu chì u sistema di reazzione hè preparatu, u modificatore di l'enzyme hè liberatu à alta temperatura (di solitu più altu di 90 ° C) durante a fase iniziale di riscaldamentu di a reazzione o "iniziu caldu", in modu chì l'ADN polimerasi hè attivatu.U tempu d'attivazione esatta è a temperatura dipendenu da a natura di l'ADN polimerasi è u modificatore hot-start.Stu metudu usa principalmente modificatori cum'è anticorpi, ligandi di affinità o modificatori chimichi per inibisce l'attività di l'ADN polimerasi.Siccomu l'attività di l'ADN polimerasi hè inibita à a temperatura di l'ambienti, a tecnulugia di partenza calda furnisce una grande comodità per a preparazione di più sistemi di reazione PCR à a temperatura di l'ambienti senza sacrificà a specificità di e reazioni PCR.
2. RT-PCR
RT-PCR (Reverse transcription PCR) hè una tecnica sperimentale per a trascrizione inversa da mRNA in cDNA è l'utilizanu cum'è mudellu per l'amplificazione.A prucedura sperimentale hè di estrattà l'RNA tutale in tessuti o cellule prima, aduprate Oligo (dT) cum'è primer, aduprate a transcriptase inversa per sintetizà cDNA, è dopu aduprà cDNA cum'è mudellu per l'amplificazione PCR per ottene u genu di destinazione o detectà l'espressione genica.
3. PCR quantitative fluorescente
PCR quantitativa fluorescente (PCR quantitativa in tempu reale,RT-qPCR) si riferisce à u metudu di aghjunghje gruppi fluoriscenti à u sistema di reazione PCR, utilizendu l'accumulazione di signali fluorescenti per monitorà tuttu u prucessu di PCR in tempu reale, è infine utilizendu a curva standard per analizà quantitativamente u mudellu.I metudi qPCR cumunimenti usati include SYBR Green I è TaqMan.
4. PCR nidificatu
A PCR nidificata si riferisce à l'usu di dui setti di primers PCR per duie volte di amplificazione PCR, è u pruduttu di amplificazione di a seconda volta hè u fragmentu di u gene di destinazione.
Se una discordanza di a prima coppia di primers (amors esterni) provoca un pruduttu micca specificu per esse amplificatu, a pussibilità chì a stessa regione non specifica hè ricunnisciuta da a seconda coppia di primers è cuntinuà à amplificà hè assai chjuca, cusì u amplificazione da a seconda coppia di primers, a specificità di a PCR hè stata migliurata.Un vantaghju di eseguisce duie volte di PCR hè chì aiuta à amplificà un pruduttu abbastanza da DNA di partenza limitatu.
5. Touchdown PCR
Touchdown PCR hè un metudu per migliurà a specificità di a reazione PCR aghjustendu i paràmetri di u ciclu PCR.
In a PCR di touchdown, a temperatura di annealing per i primi ciculi hè stabilita uni pochi di gradi sopra a temperatura massima di annealing (Tm) di i primers.A temperatura di annealing più alta pò riduce efficacemente l'amplificazione non specifica, ma à u stessu tempu, a temperatura di annealing più alta aggravarà a separazione di primers è sequenze di destinazione, risultatu in un rendimentu PCR ridutta.Per quessa, in i primi ciculi, a temperatura di l'anneling hè generalmente stabilita per diminuisce da 1 ° C per ciclu per aumentà u cuntenutu di u genu di destinazione in u sistema.Quandu a temperatura di annealing hè abbassata à a temperatura ottima, a temperatura di annealing hè mantinutu per i ciculi restante.
6. PCR diretta
A PCR diretta si riferisce à l'amplificazione di l'ADN di destinazione direttamente da a mostra senza bisognu di isolamentu è purificazione di l'acidu nucleicu.
Ci hè dui tipi di PCR diretta:
metudu direttu: piglià una piccula quantità di mostra è aghjunghje direttamente à PCR Master Mix per l'identificazione PCR;
U metudu di cracking: dopu a campionamentu di a mostra, aghjunghje à u lisatu, lisate per liberà u genoma, pigliate una piccula quantità di supernatante lisatu è aghjunghje à PCR Master Mix, eseguite l'identificazione PCR.Stu approcciu simplifica u flussu di travagliu sperimentale, riduce u tempu praticu, è evita a perdita di DNA durante i passi di purificazione.
7. SOE PCR
L'splicing di geni per estensione di sovrapposizione PCR (SOE PCR) usa primers cù fini cumplementarii per fà chì i prudutti di PCR formanu catene sovrapposte, in modu chì in a reazione di amplificazione successiva, attraversu l'estensione di e catene sovrapposte, diverse fonti di A tecnica in quale frammenti amplificati sò sovrapposti. è spliced inseme.Sta tecnulugia hà attualmente duie direzzione principale di l'applicazione: custruzzione di geni di fusione;mutazione genica diretta à u situ.
8. IPCR
La PCR inversa (IPCR) utilizza primers complementari inversi per amplificare i frammenti di DNA diversi dai due primers, e amplifica le sequenze sconosciute su entrambi i lati di un frammento di DNA noto.
L'IPCR hè stata urigginariamente cuncepitu per determinà a sequenza di e regioni scunnisciute adiacenti, è hè sopratuttu utilizatu per studià e sequenze di promotore di geni;rearrangiamenti cromusomi oncogeni, cum'è a fusione di geni, traslocazione è trasposizione;è l'integrazione di geni virali, sò ancu cumunamenti usati avà Per a mutagenesi diretta à u situ, copiate un plasmide cù a mutazione desiderata.
9. dPCR
A PCR digitale (dPCR) hè una tecnica per a quantificazione assoluta di molécule d'acidu nucleicu.
Ci sò attualmente trè metudi per a quantificazione di molécule di l'acidu nucleicu.A fotometria hè basatu annantu à l'assorbanza di e molécule di l'acidu nucleicu;PCR quantitativa fluorescente in tempu reale (PCR in tempu reale) hè basatu annantu à u valore Ct, è u valore Ct si riferisce à u numeru di ciculu chì currisponde à u valore di fluoriscenza chì pò esse rilevatu;A PCR digitale hè l'ultima tecnulugia Quantitative basatu nantu à u metudu PCR di una sola molecula per a quantificazione di l'acidu nucleicu chì hè un metudu quantitativo assolutu.
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